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Toxin三型副雞禽桿菌對SPF雞的致病力試驗方法
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三型副雞禽桿菌對SPF雞的致病力試驗方法
1．1．2 培養(yǎng)基 半合成培養(yǎng)基、雞血清雞肉湯和雞
血清雞肉湯瓊脂。參照馮文達等［9］的方法制備。
1．1．3 試驗用雞 120只35日齡 SPF 雞?購自北
京實驗動物中心?在北京所負壓隔離器內飼養(yǎng)至57
日齡。
1．2 方法
1．2．1 細菌培養(yǎng) 取凍干卵黃?用普通肉湯稀釋
后?接種雞血清雞肉湯瓊脂?于體積分數為5％ CO2
在37℃培養(yǎng)24h～48h?挑取典型菌落接種雞血清
雞肉湯?在37℃培養(yǎng)10h～12h（B 型）和18 h～
24h（A 型和 C 型）?分裝保存于－80 ℃冰柜的同
時?進行活菌計數和純粹性檢驗［10］。
1．2．2 試驗分組 將120只試驗用雞隨機分成3
組?A 型菌組40只雞?B 型菌組35只雞?C 型菌組
45只雞（表1）。
1．2．3 攻毒 從－80℃取出純粹性檢驗合格活菌
計數過的 A、B、C 型菌液?按照保存前計數的活菌數
用半合成培養(yǎng)基進行稀釋?每個劑量注射5只雞?每
只雞眶下竇內注射0．2mL。所含 cfu／0．2mL 如表
1。攻毒后24h 開始逐只檢查每只雞的發(fā)病情況?
每天檢查1次?共檢查7d［10］。
1．2．4 細菌分離 在攻毒后96h?攻毒劑量最小組
（1．5×104 cfu／0．2mL）各隨機取2只雞?進行細菌
分離［6-8］?粗提 DNA?進行 PCR［9?11-12］。
2 結果
2．1 細菌培養(yǎng)和活菌計數
B 型副雞禽桿菌 BJ-05株在雞血清雞肉湯培養(yǎng)
基 中培養(yǎng)10h 后?菌液渾濁?計數結果為10×
108cfu／mL；A 型副雞禽桿菌 C-Hpg8（CVCC254）在
雞血清雞肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h 后?可見細菌明顯
生長?計數結果為0．2×108cfu／mL；668株在雞血清
雞肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h 后?菌液較渾濁?計數結
果為4×108cfu／mL。純檢結果均未發(fā)現有其他細
菌生長。
2．2 攻毒雞只發(fā)病情況
攻毒后24h～168h?每天逐只檢查雞只的發(fā)病
情況。攻毒后24h?3大組雞只大部分發(fā)病?表現為
眶下竇腫脹?流鼻汁、有少數雞只面部水腫。攻毒后
48h?除 A 型3．0×104cfu／0．2mL 組和 B 型100×
104cfu／0．2mL 組各有1只雞沒有發(fā)病外?其余118
只雞均發(fā)病?且大部分雞只呈現明顯的雞傳染性鼻
炎臨床癥狀?眶下竇明顯腫脹?鼻孔周圍黏附飼料?
面部水腫明顯?公雞肉垂水腫。攻毒后72 h?A 型
3．0×104cfu／0．2mL 組的5只雞全部發(fā)病?其余基
本與攻毒后48h 相同。攻毒后第4天至第5天?發(fā)
病雞數和臨床癥狀與攻毒后72h 相同。至第6天?
部分發(fā)病雞只臨床癥狀減輕至消失?攻毒后第7天?
除少數雞只外?大部分雞只臨床癥狀消失。攻毒后
24h～72h 的詳細發(fā)病情況見表2。表2中的“＃"
眶下竇腫脹明顯?面部水腫?鼻汁多?有的雞只眼睛
一過性失明?公雞肉垂水腫。“＋＋＋"表示眶下竇
腫脹較明顯?鼻汁較多；“＋＋"表示眶下竇腫脹?有
鼻汁；“＋"表示用手擠壓時流出鼻汁。
2．3 細菌分離和 PCR 鑒定
從 A 型、B 型和 C 型各2只雞的眶下竇均分離
到純的副雞禽桿菌?將它們接種普通肉湯和普通瓊
脂?37℃培養(yǎng)96h?均未見細菌生長。用6個分離株
的粗提 DNA 進行 PCR?結果6／6陽性?與標準陽性
對照大小（0．5kb）一致（圖1）
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