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epicypher
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EpiDyne®染色質(zhì)重塑酶
ATP依賴(lài)的染色質(zhì)重塑酶是癌癥中常見(jiàn)的突變蛋白之一，使其成為開(kāi)發(fā)新型治療策略的要目標(biāo)。EpiDyne®平臺(tái)利用EpiCypher dNucs作為底物來(lái)研究核小體重塑。為了補(bǔ)充這些測(cè)定，EpiCypher提供了一系列重塑酶，包括SMARCA2和SMARCA4（SWI / SNF復(fù)合體的ATPase）和ACF ISWI型復(fù)合體。epicypher一級(jí)代理
EpiDyne：下一代表觀遺傳學(xué)測(cè)定的工具
EpiDyne染色質(zhì)重塑酶可用于多種測(cè)定讀數(shù)，包括：
FRET （在此處閱讀技術(shù)說(shuō)明） –兼容HTS
輻射DAM甲基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定–與HTS兼容
限制酶的可及性（在此處閱讀技術(shù)說(shuō)明）
可及性*定義的核小體底層工程，用于染色質(zhì)重塑研究
概述核小體重構(gòu)(或重定位)調(diào)節(jié)染色質(zhì)上的 dna 通路，從而影響基因表達(dá)和基因組修復(fù)。 許多 atp 依賴(lài)的重塑酶(及其多亞基復(fù)合物)與人類(lèi)疾病相關(guān)，但由于對(duì)核小體基底物的需求，它們是*的具有挑戰(zhàn)性的生物化學(xué)研究目標(biāo)。 上胚層通過(guò)開(kāi)發(fā) epidyne 解決了這個(gè)問(wèn)題，epidyne 是一系列重組核小體底物，可以在體外監(jiān)測(cè)核小體重構(gòu)活性。 在這里，我們描述了硬膜外核小體重構(gòu)底物在限制酶可及性(rea)測(cè)定中的應(yīng)用
染色質(zhì)重塑作為治療目標(biāo)核小體組織，可以嚴(yán)重?cái)_亂基因表達(dá)、 dna 修復(fù)和細(xì)胞分化，在許多人類(lèi)疾病(如癌癥、炎癥、自身免疫、精神分裂癥、心血管疾病和智能障礙)中發(fā)揮重要作用。 值得注意的是，近20% 的癌癥含有來(lái)自依賴(lài) atp 的 swi / snf 家族染色質(zhì)重塑復(fù)合體亞基的突變。 這些酶復(fù)合體通過(guò)將 dna“泵”到組織八聚體周?chē)鷣?lái)調(diào)節(jié)局部基因組訪(fǎng)問(wèn)，從而沿著 dna 重新定位核小體[1]。 在多種癌癥中觀察到 swi / snf 亞基的反復(fù)突變，這支持了腫瘤發(fā)生中的驅(qū)動(dòng)因子作用[2]。 突變復(fù)合物是理想的治療目標(biāo)，因?yàn)檫M(jìn)一步損害它們的 atp 酶活性會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞死亡，但不會(huì)損害正常細(xì)胞[2,3]。 這種現(xiàn)象被稱(chēng)為人工合成殺傷性，利用它來(lái)識(shí)別抑制劑可能導(dǎo)致具有癌癥特異性的藥物[4,5]。 核小體重構(gòu)實(shí)驗(yàn)利用重組單核小體亞層發(fā)展了 epidyne 家族的核小體重構(gòu)底物來(lái)研究染色質(zhì)再模擬酶的活性。核小體，147個(gè)堿基對(duì)的 dna 纏繞在核心組蛋白質(zhì)周?chē)砹巳旧|(zhì)的基本重復(fù)單位。 硬膜外核糖核酸體是由一個(gè)重組的人組蛋白八聚體包裹在一個(gè)含有末端核小體定位序列(147個(gè)堿基對(duì))的 dna 中，與一個(gè)70個(gè)堿基對(duì)的下游受體區(qū)相鄰。這個(gè)位置的組蛋白八聚體保護(hù)了一個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)(例如 dpnii [ gatc ]或 mfe1[ caattg ]) ，這個(gè)位點(diǎn)是通過(guò)一個(gè)相關(guān)的核小體重塑以允許 dna 切割而暴露出來(lái)的(圖1)。
這種第yi代 epidyne 底物還兼容高通量讀數(shù)，例如與 gatc 特異性的 dammethyltransferase [6,7]進(jìn)行放射標(biāo)記。 我們目前正在開(kāi)發(fā)與其他高溫超導(dǎo)平臺(tái)兼容的下一代重塑基板，包括熒光偏振和熒光分析。
圖1: epidyne 核小體重塑亞層 epidesyne 核小體重塑底物包裹著一個(gè)強(qiáng)大的核小體定位序列(widom601) ，以屏蔽一個(gè)目標(biāo)基序(綠盒子)。 目標(biāo)基序要么是限制酶識(shí)別位點(diǎn)，要么是該死的甲基化序列。 橙色 dnasequence 代表基于70對(duì)的受體區(qū)域。 在依賴(lài) atp 的重塑器(例如酵母菌 rsc，或人類(lèi) swi / snf atpase，例如 smarca2 / 4)作用后，目標(biāo)部位暴露出來(lái)，然后可以用限制酶切割或用水壩甲基化。 后者可以立即兼容 hts 應(yīng)用程序。
實(shí)驗(yàn)所需的試劑和材料: 貯存蛋白質(zhì) aliquots@- 80 c，避免凍結(jié) / 解凍酵母 rsc 重構(gòu)復(fù)合物[9](底物也與人類(lèi) smarca2 / 4 / brm / brg1復(fù)合物相容; 未顯示)•硬膜內(nèi)重構(gòu)底物(epicypher catalog catalog no。16-4101)•陽(yáng)性對(duì)照裸 dna 模板 gatc1(epicypher catalogno。 18-4101)•負(fù)面控制裸 dna 模板 gatc0(epicypher catalogno。 18-4100)•限制酶(對(duì)于 gatc 的乳溝，使用 dpnii (neb 目錄編號(hào) r0543t) ; 對(duì)于 cag 的乳溝，使用 mfei (neb 目錄編號(hào):。 分析緩沖液(20mm tris ph7.5,50mm kcl，3mm mgcl2和0.1 mg / mlbsa (sigma catalog no。 A3059)分析淬火緩沖液(新鮮: 10mm tris ph7.5,40mm edta，0.6% sds 和50g / ml 蛋白酶 k (worthington bio-chem。 公司，目錄號(hào)碼。 Proks). •8% 天然聚丙烯酰胺凝膠(37.5:1)在1xtbe-溴化乙錠(etbr，10mg / ml)中組裝 / 分解• etbr 染色 dna 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)成像裝置1。 添加硬膜外基質(zhì)，或者控制 dna (陽(yáng)性或陰性)到0.5 ml 埃本多夫試管(建議三個(gè)試管并行運(yùn)行)。 無(wú)痛分泌物的濃度會(huì)隨你特定的 atp 酶而變化。 對(duì)于 rsc，使用20nm 核小體. 2。 在預(yù)定體積中加入測(cè)定緩沖液(典型反應(yīng)為20l，相當(dāng)于 ~ 100ng dna)3。 加入染色質(zhì)重塑(例如 rsc，10nm)4。 加入50個(gè)所需限制酶(例如 dpnii)5。 通過(guò)加入2毫米 atp6引發(fā)反應(yīng)。 在23-37攝氏度(rsc 為30攝氏度)孵化反應(yīng)，以獲得所需的時(shí)間點(diǎn)7。 通過(guò)添加等量的分析淬火緩沖劑來(lái)淬火反應(yīng)，然后在50 °c 下培養(yǎng)20分鐘。 非變性丙烯酰胺凝膠樣品。 用 etbr (0.2 g / ml)在1xtbe 中染色10分鐘。 在1xtbe 中注入凝膠，在合適的成像設(shè)備上進(jìn)行可視化
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16-0009 Mononucleosomes, Recombinant Human epicypher代理 北京華新康信生物科技有限公司
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