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Biotium福建代理
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什么是細(xì)胞外囊泡?

細(xì)胞外囊泡 (EV) 是由細(xì)胞分泌的膜結(jié)合小顆粒,被認(rèn)為具有細(xì)胞信使的功能,將貨物從一個(gè)細(xì)胞運(yùn)送到另一個(gè)細(xì)胞。電動汽車有多種亞型,其功能、貨物和尺寸各不相同,直徑范圍為 ~30-1000 nm。最小的 EV 類型是外泌體,大小約為 30-150 nm。EV 起源于稱為多泡體 (MVB) 的細(xì)胞區(qū)室,其本身源自內(nèi)體的內(nèi)陷。當(dāng) MVB 與質(zhì)膜融合并釋放其貨物時(shí),囊泡被釋放。

 

在生物醫(yī)學(xué)研究中,外泌體及其貨物被用作癌癥和其他疾病的診斷生物標(biāo)志物。EV 和外泌體可以使用超速離心、PEG 沉淀和免疫捕獲珠等技術(shù)從血液或其他生物體液中分離出來。

 

外泌體膜含有源自原始細(xì)胞質(zhì)膜的跨膜蛋白,通常包括四跨膜蛋白家族的蛋白質(zhì)(如 CD9、CD63 CD81)。在內(nèi)部,外泌體包含細(xì)胞質(zhì)成分,如蛋白質(zhì)和 RNA??梢允褂?/span> RNAseq、蛋白質(zhì)印跡和流式細(xì)胞術(shù)等方法分析外泌體成分。為了通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表征,研究人員可以使用染料對膜和核酸等外泌體成分進(jìn)行染色,以及與四跨膜蛋白或其他感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。

外泌體分析:小目標(biāo),大挑戰(zhàn)

外泌體的小尺寸使其難以處理和分析。在流式細(xì)胞術(shù)中,外泌體很難與細(xì)胞碎片和其他小顆粒區(qū)分開來,它們的大小處于或低于某些流式細(xì)胞儀的靈敏度極限。用某些染料或抗體染色有助于區(qū)分外泌體和其他顆粒。然而,使用不會形成聚集體的染色劑很重要,因?yàn)檫@些小顆粒本身可能會與染色的外泌體混淆。這種聚集體一直是外泌體研究人員的挫敗感。

 

在分析之前用于富集或純化 EV 的方法也是一個(gè)重要因素。富含簡單 PEG 沉淀步驟的樣品通常含有大量非 EV 脂質(zhì)顆粒,這些顆粒也可能與膜染料結(jié)合。這些雜質(zhì)可以通過使用其他 EV 純化方法來減少,例如尺寸排阻色譜 (SEC) 或免疫沉淀。與抗四跨膜蛋白抗體結(jié)合的磁珠可以產(chǎn)生純外泌體簇。然而,這些珠子可能會與許多疏水性染料(例如膜染料)非特異性結(jié)合。

 

我們已經(jīng)篩選了大量我們的抗體和染料,以尋找那些既能很好地染色外泌體,又表現(xiàn)出極少或沒有聚集(即在沒有外泌體的情況下發(fā)出信號)的抗體和染料。繼續(xù)閱讀下文,探索我們經(jīng)過驗(yàn)證的 EV 抗體和染料。

EXOBRITE™ EV 膜染色試劑盒

ExoBrite™ EV 膜染色試劑盒旨在克服外泌體檢測的一些挑戰(zhàn)。ExoBrite™ 染料與外泌體膜中的分子結(jié)合,通過流式細(xì)胞術(shù)為分離的 EV 提供明亮、特異性的染色。ExoBrite™ 染料的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢在于,與許多其他染料不同,它們幾乎沒有或沒有與外泌體或 EV 大小相似的背景聚集體。此外,與大多數(shù)膜染料不同,ExoBrite™ 染料不會非特異性結(jié)合聚苯乙烯珠粒,這意味著它們可用于染色珠粒結(jié)合的外泌體。

 

ExoBrite™ EV 膜染色劑已在流式細(xì)胞術(shù)中得到驗(yàn)證,能夠?qū)碜远喾N不同培養(yǎng)細(xì)胞系的外泌體和 EV 進(jìn)行染色,并通過多種不同方法進(jìn)行分離,包括尺寸排阻色譜 (SEC)、聚乙二醇 (PEG) 沉淀和磁珠免疫沉淀 (IP)

 

ExoBrite™ EV 膜染色優(yōu)點(diǎn):

 

專為外泌體染色設(shè)計(jì)和配制

極低的背景可提供出色的信噪比

能夠與抗體共同染色(不同于 CellBrite® Fix MemBrite® Fix

能夠與珠結(jié)合外泌體一起使用(與大多數(shù)其他膜染料不同)

 

來自 MCF-7 細(xì)胞的珠結(jié)合外泌體的流式細(xì)胞術(shù)。未染色的外泌體(灰色)或與 10X ExoBrite™ 490/515 CD9(H19a)-CF®568(粉色)共染色。在 FITC R-PE 通道中的 CytoFLEX LX 流式細(xì)胞儀上檢測到外泌體。

ExoBrite™ EV 膜染色/抗體共染色

ExoBrite™ EV 膜染色劑的一項(xiàng)優(yōu)勢是能夠與抗體共染色,用于外泌體蛋白質(zhì)分析研究。共染色可以同時(shí)或順序進(jìn)行,并且可以在純化的或珠結(jié)合的外泌體上進(jìn)行。ExoBrite™ EV 膜染色劑是通用外泌體染色劑,應(yīng)標(biāo)記樣品中的所有外泌體*,允許使用抗體來量化表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的外泌體數(shù)量。例如,在我們測試的外泌體(MCF-7 衍生)中,四跨膜蛋白 CD9 高度且無處不在地表達(dá)。** 我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)我們與 ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain CD9 H19a)-CF®488A,它們的陽性群體幾乎*重疊(見圖,右)。

 

純化外泌體最佳 ExoBrite™/抗體共染色的提示:

 

使用 10X ExoBrite™ 1 mL 中純化的外泌體進(jìn)行染色(ExoBrite™ 染色在同時(shí)共染色期間會有所減少,因此不建議使用 1X

嘗試從至少 0.1 ug/mL 的抗體開始

*在我們測試的外泌體中,ExoBrite™ EV 膜染色劑標(biāo)記了所有外泌體??赡艽嬖诰哂胁煌旧降耐饷隗w類型。

 

**四跨膜蛋白(CD9、CD61 CD81)和其他蛋白質(zhì)的表達(dá)水平在細(xì)胞類型和外泌體來源之間差異很大。

SEC 純化的 MCF-7 衍生外泌體同時(shí)使用 1 mL 10X ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain 0.1 ug/mL CD9(H19a)-CF®488A 染色。當(dāng)對 ExoBrite™ 560/585 陽性顆粒進(jìn)行門控時(shí),約 95% CD9 也呈陽性(頂行)。同樣,當(dāng)對 CD9 陽性顆粒進(jìn)行門控時(shí),約 95% ExoBrite™ 560/585 也呈陽性(底行)

經(jīng)驗(yàn)證的外泌體抗體

用作外泌體標(biāo)志物的最常見蛋白質(zhì)是四跨膜蛋白家族的成員 CD9、CD63 CD81。四跨膜蛋白是具有許多擬議功能的質(zhì)膜蛋白,包括其他膜蛋白的活化和分選。它們還被認(rèn)為在將蛋白質(zhì)靶向多泡體 (MVB) 和外泌體方面發(fā)揮作用。這些四跨膜蛋白在許多細(xì)胞類型上廣泛表達(dá),因此可以在許多類型的外泌體上檢測到,但它們的表達(dá)水平確實(shí)因細(xì)胞來源類型而異。

 

EV 中經(jīng)常檢測到的其他蛋白質(zhì)包括熱休克蛋白(即 HSP70)、膜運(yùn)輸?shù)鞍住?/span>MVB 生物發(fā)生蛋白(即 AlixTSG101)和細(xì)胞粘附分子(即 Ep-CAM、ICAM-1)。Ep-CAM 主要在上皮細(xì)胞中表達(dá),包括細(xì)胞系 MCF-7。

 

Biotium 提供多種不同的針對外泌體標(biāo)記蛋白的抗體克隆,每種都有多種偶聯(lián)物選擇,例如亮 CF® 染料和生物素。下面列出的抗體已通過流式細(xì)胞術(shù)專門驗(yàn)證用于外泌體檢測,使用富集的 MCF-7 衍生的 EV,結(jié)合 CD63 特異性磁珠 (Thermo Fisher Scientific)

 

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