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因此，我們重點(diǎn)研究了 AT101誘導(dǎo)的 BNIP3在 MPNST 細(xì)胞中的功能作用。為了確定 BNIP3是否促進(jìn) AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細(xì)胞死亡，我們通過用 BNIP3siRNA 或?qū)φ辗前邢?span> siRNA 轉(zhuǎn)染 T265-2c 細(xì)胞來瞬時(shí)敲低 BNIP3表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn) BNIP3，而不是對(duì)照，siRNA 有效地減弱 BNIP3的表達(dá)(圖3D)。然后，我們用10或15μMAT101處理 T265-2c 細(xì)胞，并比較 BNIP3siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的細(xì)胞活力與用對(duì)照寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的細(xì)胞活力。我們發(fā)現(xiàn)，與用非靶向 siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，在 BNIP3敲低的細(xì)胞中，AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡顯著減弱(圖3E)。我們得出結(jié)論，BNIP3是 AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細(xì)胞毒性的重要介質(zhì)。 AT101引起 HIF-1α 蛋白的積累，其調(diào)節(jié) BNIP3表達(dá) BNIP3是 HIF-1α 的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，已顯示調(diào)節(jié) BNIP3表達(dá)以響應(yīng)缺氧[40]和神經(jīng)酰胺處理的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞[41]。HIF-1α 可以在缺氧條件下和其他非缺氧刺激后積累[42]。AT101或棉酚處理對(duì) HIF-1α 蛋白水平的積累尚未見報(bào)道。因此，我們檢測了 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞中 HIF-1α 的蛋白水平。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理增加了 T265-2c 細(xì)胞中 HIF-1α 蛋白的水平(圖4A) ，而沒有伴隨的 HIF-1α mRNA 的增加(圖4B)。我們還發(fā)現(xiàn)，在 AT101處理后，HIF-1α 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)積累(圖4C) ，在那里它被證明具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。來確定是否

BNIP3是 HIF-1α 的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，已顯示其調(diào)節(jié)缺氧反應(yīng)中的 BNIP3表達(dá)[40]和用神經(jīng)酰胺處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞[41]。HIF-1α 可以在缺氧條件下和其他非缺氧刺激后積累[42]。AT101或棉酚處理對(duì) HIF-1α 蛋白水平的積累尚未見報(bào)道。因此，我們檢測了 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞中 HIF-1α 的蛋白水平。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理增加了 T265-2c 細(xì)胞中 HIF-1α 蛋白的水平(圖4A) ，而沒有伴隨的 HIF-1α mRNA 的增加(圖4B)。我們還發(fā)現(xiàn)，在 AT101處理后，HIF-1α 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)積累(圖4C) ，在那里它被證明具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。為了確定 HIF-1α 是否轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) BNIP3表達(dá)，我們瞬時(shí)敲低了 T265-2c 細(xì)胞中的 HIF-1α 表達(dá)(圖4D) ，并檢查了 AT101處理后對(duì) BNIP3表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn) HIF-1αsiRNA 而不是對(duì)照 siRNA 抑制 AT101處理的細(xì)胞中 BNIP3的表達(dá)(圖4E)。我們的結(jié)論是，AT101導(dǎo)致 HIF-1α 蛋白在 MPNST 細(xì)胞中的積累，從而促進(jìn) BNIP3的表達(dá)。

圖4。AT101通過 HIF-1α 積累刺激 BNIP3表達(dá)。用 AT101處理的 T265-2c 細(xì)胞(10μM，24小時(shí))表現(xiàn)出 HIF-1α 蛋白水平增加(A) ，但是 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞相對(duì)于未處理的細(xì)胞不顯示 HIF-1αmRNA 水平(B)的顯著變化。AT101導(dǎo)致 T265-2c 細(xì)胞核部分 HIF-1α 蛋白水平升高(C)。相對(duì)于用非靶 siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用 AT101處理后，用 HIF-1αsiRNA 轉(zhuǎn)染的 T265-2c 細(xì)胞顯示 HIF-1α 蛋白(D)和 BNIP3蛋白表達(dá)(E)的水平降低。# = 不重要。

AT101通過細(xì)胞內(nèi)鐵螯合作用引起 HIF-1α 的積累除了缺氧之外，某些非缺氧刺激如雌激素、胰島素和表皮生長因子[43]-[45]可以在常氧條件下誘導(dǎo) HIF-1α 的表達(dá)。有趣的是，槲皮素和高良姜素等多酚也可以誘導(dǎo) HIF-1α 蛋白的積累，而不增加 HIF1-α mRNA 水平[46] ，正如我們?cè)?span> AT101中觀察到的。這種作用被認(rèn)為是通過細(xì)胞內(nèi)鐵螯合作用介導(dǎo)的[46] ，[47]。因此，我們接下來詢問鐵是否參與 AT101誘導(dǎo)的 HIF-1α 積累，BNIP3表達(dá)和 MPNST 細(xì)胞死亡。為了解決 AT101是否干擾細(xì)胞內(nèi)鐵水平，我們?cè)u(píng)估了用 AT101處理的 MPNST 細(xì)胞中運(yùn)鐵蛋白受器1(TfR1)和鐵蛋白(重鏈)的蛋白質(zhì)水平。TfR1是一種載體蛋白，促進(jìn)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞[48]。TfR1的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后受到調(diào)控，并與細(xì)胞內(nèi)鐵濃度呈負(fù)相關(guān)。此外，鐵蛋白重鏈催化細(xì)胞內(nèi)鐵儲(chǔ)存的第一步，其蛋白質(zhì)水平對(duì)應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)鐵水平[48]。我們發(fā)現(xiàn) AT101處理增加了 T265-2c 和90-8細(xì)胞中的 TfR1蛋白水平并降低了鐵蛋白重鏈蛋白水平，并且當(dāng)培養(yǎng)基補(bǔ)充檸檬酸鐵(100μM)作為鐵離子的來源時(shí)，這些 AT101效應(yīng)被阻斷(圖5A)。為了確定鐵螯合是否是 AT101誘導(dǎo) HIF-1α 積累以及隨后的 BNIP3和自噬的機(jī)制，我們?cè)u(píng)估了補(bǔ)鐵對(duì)這些事件的影響。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵消除了由 AT101誘導(dǎo)的 HIF-1α，BNIP3和 LC3II 的積累(圖5B)。為了進(jìn)一步評(píng)估補(bǔ)鐵對(duì) AT101誘導(dǎo)的 MPNST 細(xì)胞毒性的功能相關(guān)性，我們?cè)u(píng)估了添加檸檬酸鐵后的細(xì)胞活力。

我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基的鐵補(bǔ)充對(duì) T265-2c 和90-8細(xì)胞中 AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性提供了顯著的保護(hù)(圖5C，D)。AT101對(duì) MPNST 細(xì)胞的這些作用與 DFO (一種著名的鐵螯合劑)的作用相似。向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加檸檬酸鐵不能影響 ABT737的細(xì)胞毒作用，ABT737是 T265-2c 和90-8細(xì)胞上結(jié)構(gòu)上不同的 BH3模擬物(圖5E，F)。

圖5。補(bǔ)鐵保護(hù) MPNST 細(xì)胞免受 AT101誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。 AT101(15μM，24小時(shí))處理增加了 MPNST 細(xì)胞中的運(yùn)鐵蛋白受器1(TfR1)蛋白水平并降低了鐵蛋白水平(A) ，這通過向培養(yǎng)基中加入檸檬酸鐵逆轉(zhuǎn)。補(bǔ)充檸檬酸鐵(100μM)的培養(yǎng)基也消除了在 T265-2c 和90-8細(xì)胞(C，D)中 AT101誘導(dǎo)的 HIF-1α，BNIP3和 LC3II 蛋白表達(dá)(B)和細(xì)胞毒性。通過用檸檬酸鐵(100μM)(E，F)補(bǔ)充培養(yǎng)基，MPNST 細(xì)胞不能從 ABT737(15μM)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中拯救。DFO (50μM，24小時(shí))作為鐵螯合陽性對(duì)照。* p-value < 0.05.# = 不重要。

討論 AT101是棉酚的修飾對(duì)映體，一種天然存在的抗凋亡 BCL-2蛋白的小分子拮抗劑[49] ，[50]。AT101及其母體化合物棉酚已被證明在廣泛的癌細(xì)胞中具有細(xì)胞毒性作用，AT101目前正在進(jìn)行幾種癌癥的 II 期臨床試驗(yàn)[51]-[54]。除了通過計(jì)算機(jī)輔助分子建模，核磁共振成像和熒光偏振測定被鑒定為 BH3模擬物外，其他研究已經(jīng)證明棉酚可以抑制 DNA 合成[19] ，細(xì)胞能量代謝[55] ，蛋白激酶C [21] ，端粒酶[57]和人類有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白，EG5[58]。除了這些作用之外，棉酚還可以調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)[20]和 TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)[59]。在結(jié)構(gòu)研究表明棉酚是一種 BH3模擬物后，發(fā)現(xiàn)棉酚可以通過增加活性氧類，激活 p53[61]和抑制 NF-κB 活性來激活內(nèi)在的凋亡途徑[62]。此外，棉酚可以增加促凋亡 BH3-only 蛋白的表達(dá)[23] ，并誘導(dǎo) BCL-2中的構(gòu)象改變，使其促凋亡[63]。由于棉酚細(xì)胞毒作用的機(jī)制可能受到癌細(xì)胞和其他腫瘤特異性因素的遺傳特征的影響，鑒定 AT101細(xì)胞毒作用的相關(guān)機(jī)制對(duì)于評(píng)估其在 MPNST 治療中的潛在用途是重要的。